忍耐強い

Jun 27, 2023

Nature Microbiology volume 7、pages 1376–1389 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 オミクロン変異体は感染力が非常に高く、認可された治療用ヒトモノクローナル抗体 (mAb) による中和に耐性があり、ワクチン媒介免疫に対する感受性が低いです。 Omicron に対する追加の治療法を提供するために、以前に感染したワクチン接種を受けたドナーから P2G3 という名前の mAb を単離し、Omicron BA.1、BA.1.1、BA.2、および試験した他のすべての変異体に対してピコモル範囲の中和活性があることを示しました。我々は、分解能3.04Åのクライオ電子顕微鏡を使用して、Omicronスパイクと複合したP2G3 Fabの構造を解析し、以前に報告されたmAb結合スパイクエピトープとは異なるクラス3 mAbとしてP2G3エピトープを同定した。 SARS-CoV-2 オミクロンサル攻撃モデルを使用して、P2G3 を単独で、または P5C3 (以前に同定された広範に活性なクラス 1 mAb) と組み合わせて、完全な予防または治療的保護が得られることを示します。インビトロでP2G3またはP5C3による中和を回避するSARS-CoV-2変異体を選択することはできたが、それらの感染力は低く、「エスケープ」変異体は公開配列データベースでは極めてまれである。我々は、この mAb の組み合わせには抗オミクロン薬としての可能性があると結論付けています。

SARS-CoV-2 は、世界中で 3 億 4,000 万人以上の感染者と 550 万人以上の死者を出しています1。その伝播により、より感染しやすく、免疫反応に耐性のある懸念される変異種（VOC）が出現しました。元の SARS-CoV-2 株と比較して多数の変異を保有する VOC が優勢であり、デルタ (B.1.617.2) とその 11 ～ 15 個のスパイク変異は現在、感染性の高いオミクロン変異体 (B.1.1.529.1) に大部分が置き換えられています。）、スパイクタンパク質に最大 37 個のアミノ酸変異が含まれています 2,3。 Omicron のスパイク置換のうち 15 個は、受容体結合ドメイン (RBD) にあります。この領域は、すべて元の 2019-nCoV 武漢株に対して作られた中和抗体 (感染または現在のワクチンによって誘導されたもの) の標的となる領域です 4,5,6,7 、8。また、オミクロンは、これまでに報告されているほとんどの抗 SARS-CoV-2 mAb による中和に耐性があり 9,10,11,12,13,14,15、現在、BA.1.1、BA.2 (B.1.1) を含むいくつかの亜変異体として流通しています。 .529.2) および BA.3 (B.1.1.529.3)2 に準拠しており、予防と治療の両方に対する緊急の満たされていない医療ニーズが生じています。

私たちは、100人を超えるドナーからなるコホートからの血清サンプル中の抗スパイク抗体の存在をスクリーニングし、mRNA-1273ワクチンを2回接種し、血清抗体レベルが最も高く、幅広い範囲を示した1人の感染後ドナーに焦点を当てました。三量体スパイク-ACE2代替中和アッセイにおけるSARS-CoV-2変異体のパネルに対する16。高親和性スパイク結合についての B 細胞クローン上清のスクリーニングにより、ExpiCHO 細胞における重鎖と軽鎖のペアの発現による mAb 産生のために 6 つのクローンを優先することができました。これらの精製した mAb の初期プロファイリング中に、P2G3 は、元の 2019-nCoV スパイク三量体と、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ VOC で見つかった変異をコードするスパイクタンパク質のパネルに対して最も強い結合親和性を示しました (IC50 は 0.006 ～ 0.010 μg ml-1)。 ) (拡張データ図 1a)。承認済みまたは臨床的に先進的な抗 SARS-CoV-2 mAb のパネル（Regeneron17 の REGN10933 および REGN10987、AstraZeneca18 の AZD8895 および AZD1061、Adagio19 の ADG-2、Vir/GSK20 の S309/Sotrovimab）を使用して実施された交差競合スパイク RBD 結合研究）および我々のグループによって以前に記載されたmAb21は、P2G3が、AZD1061およびS309/ソトロビマブの両方によって認識されるエピトープと重複しているにもかかわらず、独特のエピトープに結合することを実証し、後者は、RBD/ACE2相互作用の遮断とは異なるメカニズムによって作用する20（拡張データ図1b）。重要なことに、当社の強力で広範囲に活性なクラス 1 mAb、P5C3 は、P2G3 と非競合的に RBD に結合したため、その後の研究のためにこれらの mAb を単独および組み合わせてプロファイリングすることが促されました。

42-fold more potent than ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 and REGN10987 mAbs and 19-fold more potent than Sotrovimab at neutralizing Omicron BA.1 spike-pseudotyped lentiviral particles (Fig. 2b). Second most potent was P5C3, with an IC80 value of 0.223 µg ml−1, and the P2G3/P5C3 combination revealed a minor-enhanced activity over P2G3 alone in this assay, with an IC80 value of 0.024 µg ml−1 for the total concentration of the two mAbs. Furthermore, P2G3 and P5C3 maintained full neutralizing activity against the ancestral D614G and Omicron BA.1.1 encoding the R346K spike pseudovirus (Extended Data Fig. 2a,b), a mutation present in ~10% of Omicron variant sequences in the GISAID11./p>10× less potent than P2G3, P5C3 and both the AZD and REGN cocktails against this virus./p>6.2 µg ml−1 at the time of viral inoculation and P2G3 treatment groups showed a significant ~4-log reduction of genomic viral RNA levels (Extended Data Fig. 4c)./p>1,200 Å2 (Fig. 5b and Extended Data Figs. 7a and 8a). To characterize the P2G3 paratope and epitope interface in detail, we performed local refinement of the P2G3 Fab-RBD interacting region and reached a resolution of 3.84 Å with well-defined density, allowing clear interpretation of sidechain positions (Extended Data Figs. 6 and 8, and Supplementary Fig. 2 and Data Table 1). The P2G3 paratope is composed of four complementarity-determining region (CDR) loops binding at the back of the RBD. The interactions are mediated through electrostatic and hydrophobic contacts (Fig. 5c,d and Extended Data Fig. 8b,c) and involve 16 residues of the RBD, mainly bound by the heavy chain of the P2G3 mAb. The 18-residue-long CDRH3 sits at the top of a loop that comprises residues 344–347, and also contacts the amino acids at the limits of the 5-stranded β-sheet (residues 440–451), overall accounting for >60% of the buried surface area (431 Å2) (Extended Data Fig. 8a–c). The interactions between P2G3 and the Omicron RBD are conserved in both RBD-up and RBD-down states (Extended Data Fig. 8c,d). CDRH2 extends the epitope by interacting with R346 that is engaged by residue W53 via a potential cation-pi interaction (Fig. 5d and Extended Data Fig. 8e), an interaction that is probably conserved with the R346K spike substitution (Extended Data Fig. 2a,b). The only potential contact from the light chain derives from the CDRL1 Y32 forming a hydrophobic interaction with V445 of the RBD (Extended Data Fig. 8c). Moreover, P2G3 is only observed to contact RBD amino acid residues and the distance to the nearest atom of the glycan branch is ~10 Å from P2G3. Importantly, the epitope defined by our structural studies rationalizes the potent neutralizing activity of P2G3 against the Omicron variant relative to other Class 3 mAbs. Omicron mutations S371L, N440K, G446S and the minor R346K sub-variant are all situated outside of, adjacent to or have little effect on recognition of the P2G3-binding epitope, whereas two or more of these mutations directly impinge on epitopes recognized by REGN10987, AZD1061 and S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Furthermore, P2G3 displays a unique binding orientation on the RBD, with its Fab angling away from most of these Omicron mutations (Fig. 5f). In modelling the observed angles of attack of various Class 3 mAbs, it is possible that REGN10987 only binds to the up-RBD form while AZD1061 binds one up- and one down-RBD form, with steric hindrance blocking the third RBD site on the Omicron spike trimer (Extended Data Fig. 9). In contrast, P2G3 and S309/Sotrovimab probably binds both the up and down forms of Omicron RBD without clashes (Fig. 5g and Extended Data Fig. 9c), a characteristic that may contribute to the largely conserved and high potency of P2G3 across VOCs./p>

99% by SDS–PAGE analysis. Biotinylation of spike or RBD proteins was performed using EZ-Link NHS-PEG4-biotin (Life Technologies) with a 3-fold molar excess of reagent following the manufacturer’s protocol. Biotinylated proteins were buffer exchanged with PBS using an Amicon Ultra-0.5 with a 3 kDa molecular weight cut-off. Spike and RBD tetramers were prepared fresh before use and formed by combining biotinylated proteins with PE-conjugated streptavidin (BD Biosciences) at a molar ratio of 4:1./p>100 donors were monitored for levels of IgG antibody binding to the SARS-CoV-2 spike trimer proteins from 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta and Gamma variants in the Luminex bead-based assay./p>

1-log reduction in viral RNA and infectious virus anticipated in the lung tissue with an effective therapy that can provide statistically significant differences between treated and untreated animals. These sample size assumptions were confirmed in our statistical analysis. Statistical differences in viral RNA levels and infectivity were evaluated using the Mann-Whitney two-sided tests to compare control and treatment groups./p>

4000 cells analysed per condition. c, d) Antibody dependent cellular phagocytosis assay performed ancestral 2019-nCoV and with Omicron BA.1 variant Spike protein biotinylated and bound to streptavidin coated fluorescent beads. Beads mixed with the indicated antibody concentrations were incubated with the U937 monocyte effector cell line and antibody dependent cellular phagocytosis of the Spike coated beads was evaluated by flow cytometry. Dashed lines correspond to individual antibodies and solid lines indicate combinations of P2G3 and P5C3. Results shown are representative data for three separate experiments with each concentration response tested in duplicates or triplicates. Mean values ± SEM are shown./p>

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